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基于調節未折疊蛋白反應探討針刺干預復吸海洛因腦損傷 機制的研究

作者:孫夢曉 來源:本站原創 點擊:503次 更新:2018-04-28
  

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(1 安徽中醫藥大學針灸經絡研究所  合肥  230038;2 安徽中醫藥大學第二附屬醫院合肥  230061;3 安徽省立醫院南區康復科,合肥 230036)

1 研究背景

      藥物成癮既影響個人健康又威脅到社會的穩定和發展。 藥物成癮屬慢性復發性腦病,研究如何干預、?;せ蛐薷春B逡蚰運鶘思捌渥饔沒蒲芯?,值得關注。針刺干預海洛因腦損傷在防治藥物成癮研究領域中具有特色。已有大研究表明,海洛因成癮對腦組織具有慢性損害,其中神經元凋亡是海洛因成癮致腦神經元損傷的主要形式。那么,復吸海洛因是否可引發腦組織細胞凋亡?觀察針刺對未折疊蛋白反應,是否可以闡述針刺干預海洛因腦損傷的可能機制?研究如何干預、?;せ蛐薷春B逡蚰運鶘思捌渥饔沒蒲芯?,具有重要的現實意義。

2 研究方法

      本研究以腦海馬、 VTA  為觀察點,以未折疊蛋白反應通路為切入點,提出"調節未折疊蛋白反應是針刺干預海洛因腦損傷的作用機制之一"的假說。依照建立海洛因成癮大鼠模型的方法,連續遞增量肌肉注射海洛因為染毒。染毒后停止肌肉注射海洛因,為自然戒斷(戒斷)。 按染毒(成癮)→戒斷的方法, 周而復始反復三個階段 (染毒→戒斷→染毒→戒斷→染毒→戒斷) 建立海洛因復吸大鼠模型。設正常組、對照組、針刺組、美沙酮組,觀察針刺百會、大椎穴對海洛因復吸大鼠海馬、VTA  超微結構的影響,運用未折疊蛋白應答功能基因芯片探尋針刺干預海洛因腦損傷起效基因,運用 RT -qPCR、Western blout 和免疫組化等分子生物學技術對分子伴侶和折疊蛋白  GRP78、 CRT,跨膜感受蛋白  IRE1、PERK  等部分關鍵基因、及泛素和蛋白酶做驗證性檢測。

3 結果與討論

      研究發現復吸海洛因導致神經元細胞凋亡增加,表明海洛因對腦組織具有損傷作用。針刺百會、大椎抑制細胞凋亡,為針刺干預海洛因腦損傷提供了形態學依據(圖略)。CHOP  表達升高是內質網應激反應的標志。我們的研究表明,針刺可抑制復吸海洛因成癮大鼠內質網應激反應的標志蛋白 CHOP 的表達,促進內質網應激反應的標志性分子伴侶蛋白 GRP78 表達,調控內質網應激,從而起到?;ど窬鶘俗饔?。進一步觀察發現,海馬、VTA  腦區  CRT、GRP78  表達量明顯低于正常大鼠,表明注射海洛因具有抑制  CRT、GRP78  表達的作用(圖略),這對維持細胞內質網內穩態, 促進未折疊蛋白折疊, 阻止細胞凋亡不利。 針刺“百會”、 “大椎”穴可抑制神經細胞凋亡,增加  CRT、GRP78  表達,有利于快速與轉運入內質網管腔的新合成蛋白結合,參與新蛋白的折疊、寡聚化、成熟等翻譯后修飾過程,幫助未折疊蛋白形成具有活性的功能性蛋白,轉移至高爾基體,防止未折疊和(或)錯誤折疊蛋白質的輸出,對細胞生存起到促進作用。針刺調控  GRP78  表達在針刺干預海洛因腦損傷作用機制研究中首次報告。經未折疊蛋白反應芯片檢測發現,復吸海洛因大鼠海馬  HSP70、HSP105  和  Vcp  下調,而針刺改變HSP70、HSP105  和  Vcp  的下調(圖略),通過提高內質網折疊能力,調控復吸海洛因大鼠未折疊蛋白反應起到抑制細胞凋亡的效應,減少海洛因復吸大鼠腦神經細胞凋亡,發揮干預腦損傷的作用。首次闡釋了針刺干預海洛因腦損傷作用與未折疊蛋白反應有關的起效基因。

      基于從泛素-蛋白酶體途徑,觀察海洛因復吸大鼠腦  Ub、E3、26S  的變化,對  UPR  通路的蛋白降解中的部分主要關鍵基因加以檢測分析,探討針刺通過調控蛋白降解干預海洛因腦損傷的分子機制。發現針刺百會、大椎穴后,大鼠中樞神經細胞凋亡減少,VTA 和海馬中 Ub、E3,26S 表達下降(圖略),提示中樞神經損傷受到抑制,體內異常蛋白量下降,細胞趨于自身穩態。 中醫認為,腦主管精神意識思維活動。而海洛因可以引起人體各系統的損害,尤以腦部損害較為多見,主要表現為意識、精神障礙、抽搐發作等。督脈循行于脊里,入絡于腦,且督脈多主神志病,百會、大椎為督脈本經穴,百會穴位于巔頂部,其深處即為腦之所在,現代研究也發現百會穴淺表分布著豐富的血管和神經,如枕大神經、額神經分支,深層有大腦皮質運動區和旁中央小葉,因此刺激百會穴對改善中樞神經的功能及血液循環有直接調節作用;大椎穴為手足三陽經與督脈的交會穴,其內可通行督脈,外可游走三陽。針刺督脈百會、大椎穴其功效為可以振奮全身之陽氣,疏通經絡、健腦補髓、醒腦開竅,具有促進腦神經康復之功效。通過調控參與蛋白質折疊、內質網降解途徑等神經營養因子、泛素化、熱休克蛋白等物質的活性,增加分子伴侶  HSP70、HSP105  和  Vcp 表達,來提高內質網折疊能力,減少海洛因復吸大鼠腦神經細胞凋亡,這可能是針刺百會、大椎穴

干預干預海洛因復吸大鼠腦損傷的作用機制之一。本項研究為針刺干預海洛因腦損傷的作用提供形態學的依據,首次闡釋了針刺干預海洛因腦損傷作用與未折疊蛋白反應有關的起效基因,針刺調控分子伴侶和折疊蛋白  GRP78、CRT,跨膜感受蛋白IRE1、PERK  等表達的效應,從細胞、蛋白、基因水平,闡釋針刺通過調控內源性生物活性物質起到干預?;ずB逡蚰運鶘說淖饔沒?,在針刺干預海洛因腦損傷作用機制研究中首次報告。本項研究既為針灸戒毒康復提供了科學依據,豐富了針灸理論,又促進了針灸戒毒康復的臨床應用。